La détection du génome du VIH, VHB et du VHC est devenue obligatoire
Qualification et préparation

Dépistage du génome viral (DGV)

Depuis le 1er Octobre 2001, la détection du génome du VIH et du VHC est devenue obligatoire en France, alors que la détection du génome VHB n'a été mise en place qu'en 2010.

Un virus est un germe intracellulaire qui se caractérise par son incapacité à se reproduire par division, et requiert donc une cellule hôte pour sa multiplication. Il est composé d'une molécule d'acide nucléique (soit d'ADN, soit d'ARN, simple ou double brin, linéaire ou circulaire, mono ou polysegmentée) entourée d'une coque de protéines appelée capside, et parfois d'une enveloppe. Le dépistage du génome viral (DGV) consiste à rechercher l'acide nucléique des virus.

Cette technique permet de détecter des infections très récentes, avant même que les anticorps ne soient détectables par les tests sérologiques. Elle a ainsi permis de réduire la fenêtre silencieuse ou fenêtre sérologique (période dans laquelle le germe d'une personne contaminée est indétectable), de 11 jours pour le VIH-1 passant de 22 à 11 jours en moyenne, de 49 jours pour le VHC passant de 58 à 9 jours en moyenne, et de 25 jours pour le VHB passant de 50 jours à 25 jours.

 

Technique de DGV


La réalisation du Dépistage du Génome Viral repose sur trois étapes :

  • Préparation de l’échantillon : extraction des acides nucléiques
  • Amplification d’une séquence spécifique du génome du virus recherché par PCR (polymerase chain reaction) ou TMA (Transcription Mediated Amplification)
  • Détection des produits amplifiés

 

Préparation de l’échantillon

La préparation des échantillons des donneurs de sang consiste en l'extraction des acides nucléiques par la lyse des membranes cellulaires et des enveloppes virales par voie enzymatique (protéinase K), ou chimique (thiocyanate de guanidium). Les acides nucléiques sont ensuites séparés du milieu réactionnel et des résidus plasmatiques à l'aide de billes de silice ou par capture à l'aide de sondes (courts fragments d’ADN ou d’ARN), dont la séquence est complémentaire d’une séquence spécifique de l’acide nucléique que l’on veut extraire.

 
Amplification par PCR
 
L'amplification par PCR est une véritable multiplication exponentielle d’une séquence nucléotidique précise par un enchaînement de cycles :
  • Dénaturation thermique
  • Hybridation avec un couple d’amorces
  • Elongation de chaque amorce par la Taq polymérase
 
Amplification par TMA
 
Cette technique d'amplification permet, à partir d'un ADN double brin, d'obtenir des milliards de copies d'ARN à température constante. Cette multiplication est réalisée par l'utilisation de la T7 ARN polymérase. La différence, par rapport à l'amplification par PCR, est la possibilité de dépister simultanément les génomes des virus HIV1 et HCV dans la même réaction.

 

Détection des Acides nucléiques

Avant la détection des acides nucléiques, des pools (mélange du sang de plusieurs donneurs) sont réalisés pour gagner du temps dans les analyses et permettre la transfusion des produits sanguins, sauf pour les DOM. Pour les analyses réalisées par TMA, les pools sont composés de 8 échantillons alors que pour la PCR, 24 échantillons sont analysés par pool.

Pour la technique de PCR, la détection des acides nucléiques est réalisée par des sondes (courts fragments d’ADN ou d’ARN) spécifiques de l'ARN viral, fixées sur des particules magnétiques. Des amplicons marqués à la biotine sont ajoutés, puis un conjugué d'avidine et de péroxydase. Après lavage, un substrat est ajouté afin de lire les résultats.

Pour la technique de TMA, les amplicons sont détectés à l’aide de sondes marquées à l’ester d’acridinium. La lecture est effectuée par chemiluminescence en milieu alcalin.

 

Limites de la DGV


La DGV a permis de détecter la présence de virus, avant l'apparition des anticorps chez le donneur. Mais lorsque le nombre de virus est trop faible, la DGV ne permet pas de détecter la présence de ces virus. Cela peut être le cas en début de contamination ou lors de séroconversion.

La recherche de l'acide nucléique du virus est dépendante du virus (HIV-2 non dépisté) et des variations génétiques des souches virales. Certaines variations génétiques du virus ne pourront pas être détectées par la DGV.

Enfin, l'acide nucléique a pu être dégradé lors du prélèvement des échantillons, à cause de la présence d'inhibiteurs dans le prélèvement, comme l'héparine.