Le test direct à l'antiglobuline (TDA), également appelé épreuve directe à l'antiglobuline (EDA) et anciennement test de Coombs direct, permet de mettre en évidence la présence d'immunoglobulines et/ou de fractions du complément fixées in vivo à la surface des globules rouges.
L'antiglobuline humaine (AGH) utilisée peut être polyspecifique, contenant notamment un anti-IgG et un anti-C3d, ou monospecifique, par exemple anti-IgG ou anti-C3d.
L'anti-IgG permet de détecter principalement les IgG fixées sur les hématies. L'anti-C3d met en évidence le fragment C3d du complément qui reste fixé à la membrane après activation et dégradation du C3b. La présence de C3d peut notamment être observée lors de réactions impliquant des anticorps capables d'activer le complément, en particulier certains auto-anticorps IgM. Cependant, un TDA positif avec anti-C3d ne permet pas, à lui seul, de déterminer la classe de l'anticorps responsable.
Le TDA est notamment utilisé dans l'exploration des anémies hémolytiques auto-immunes (AHAI), des maladies hémolytiques du fœtus et du nouveau-né (MHNN), des réactions transfusionnelles et de certaines hémolyses immunologiques d'origine médicamenteuse.
Un TDA positif témoigne d'une sensibilisation des hématies, mais ne signifie pas nécessairement qu'une hémolyse est présente. À l'inverse, une hémolyse d'origine immune peut exceptionnellement être associée à un TDA négatif, notamment lorsque la quantité d'immunoglobulines ou de complément fixée aux hématies est inférieure à la limite de détection de la méthode ou lorsque les immunoglobulines impliquées ne sont pas correctement détectées par le réactif utilisé. Le seuil de détection dépend de la méthode et du réactif ; il n'est donc pas approprié de retenir une valeur universelle de 200 molécules par hématie.
Différentes techniques
Le TDA peut être réalisé selon différentes méthodes, notamment en tube, par agglutination en colonne (gel ou microbilles) ou par certaines techniques automatisées en phase solide ou en microplaque. Les performances et les limites de détection peuvent varier selon la méthode utilisée.
Technique en tube :
La technique en tube consiste à utiliser les globules rouges du patient, préalablement lavés, puis à les mettre en présence de l'antiglobuline humaine.
Le lavage est une étape essentielle : il permet d'éliminer les immunoglobulines et les protéines du plasma qui ne sont pas fixées aux hématies et qui pourraient interférer avec l'antiglobuline.
Après lavage, les hématies sont mises en présence d'une antiglobuline anti-IgG, anti-C3d ou polyspecifique. Après centrifugation, une agglutination indique que les hématies étaient sensibilisées par les immunoglobulines et/ou le complément recherchés. Un contrôle approprié peut être utilisé selon le réactif et la méthode afin de vérifier la validité de la réaction.
La technique en tube reste une méthode importante, notamment pour la confirmation de résultats obtenus par d'autres méthodes.
Voici l'image que peuvent donner les résultats en tube :
Technique en colonne :
La technique en colonne, utilisant un gel ou des microbilles, est largement utilisée en immuno-hématologie et peut être automatisée.
Les hématies du patient sont introduites dans une microcolonne contenant un milieu de séparation et, selon le système utilisé, un réactif antiglobuline.
Après centrifugation, les hématies non agglutinées traversent la colonne et forment un culot au fond. Les hématies agglutinées sont retenues dans le gel ou les microbilles, à différents niveaux de la colonne.
Cette méthode permet une lecture standardisée des réactions et facilite l'automatisation. Elle ne repose donc pas simplement sur une augmentation de la taille du complexe immun : c'est l'état d'agglutination des hématies qui conditionne leur migration dans la colonne.
Voici l'image que peuvent donner les résultats en colonne :
- Autres techniques :
Le TDA peut également être réalisé avec des systèmes automatisés utilisant notamment la phase solide, la microplaque ou d'autres technologies. Ces méthodes permettent une automatisation importante de l'analyse et une lecture standardisée.
TDA avec de l'anti-IgG
Le TDA avec anti-IgG permet de mettre en évidence des IgG fixées in vivo sur les globules rouges.
Il est particulièrement important dans l'exploration des AHAI à anticorps chauds et peut également être utilisé dans le bilan des MHNN et des réactions transfusionnelles.
Lorsqu'une sensibilisation par des IgG est mise en évidence dans un contexte clinique approprié, il peut être nécessaire de rechercher la spécificité des anticorps fixés aux hématies. Une élution peut alors être réalisée afin de récupérer les anticorps présents à la surface des globules rouges, puis l'éluat peut être étudié par des techniques d'identification.
Il faut toutefois distinguer la mise en évidence des IgG fixées de l'identification de leur spécificité : un TDA positif ne permet pas, à lui seul, de déterminer quel antigène ou quel anticorps est responsable de la sensibilisation.
TDA avec de l'anti-C3d
Le TDA avec anti-C3d permet de mettre en évidence la présence du complément, principalement sous forme de C3d, à la surface des hématies.
Ce résultat est fréquemment observé lorsque des anticorps ayant activé le complément se sont fixés aux hématies. Les anticorps IgM sont particulièrement efficaces pour activer le complément, mais la présence de C3d ne signifie pas nécessairement que l'anticorps responsable est une IgM : certains anticorps IgG peuvent également activer le complément.
Le TDA anti-C3d est notamment important dans l'exploration des maladies des agglutinines froides, dans lesquelles le TDA est généralement fortement positif pour C3d et négatif ou faiblement positif pour IgG.
Il est donc incorrect de considérer les anticorps IgM comme sans importance en transfusion ou en pathologie : certains auto-anticorps IgM, notamment les agglutinines froides ayant une amplitude thermique importante, peuvent entraîner une activation du complément et une hémolyse cliniquement significative.
TDA avec anti-IgG et anti-C3d : TDA mixte
Un TDA est parfois qualifié de mixte lorsque les hématies réagissent à la fois avec l'anti-IgG et l'anti-C3d.
Cette situation signifie que des IgG et du complément sont présents à la surface des hématies. Elle peut notamment être observée dans certaines AHAI à anticorps chauds avec activation du complément ou dans certaines formes dites mixtes d'AHAI.
La présence simultanée d'IgG et de C3d ne permet toutefois pas d'identifier à elle seule la spécificité de l'anticorps responsable. Une exploration complémentaire peut être nécessaire en fonction du contexte clinique et immuno-hématologique.
Fabrication des antiglobulines humaines (AGH)
Les réactifs d'antiglobuline humaine sont des anticorps dirigés contre des immunoglobulines humaines et/ou contre certaines fractions du complément.
Historiquement, les antiglobulines étaient notamment obtenues par immunisation d'animaux, tels que le lapin, avec des immunoglobulines ou des composants humains appropriés. Cette approche permet d'obtenir des réactifs polyclonaux.
Aujourd'hui, les réactifs peuvent également être constitués d'anticorps monoclonaux, produits notamment à partir de technologies utilisant des hybridomes. Les antiglobulines commerciales peuvent ainsi contenir différents anticorps selon leur utilisation : anti-IgG, anti-C3d ou des formulations polyspecifiques associant plusieurs activités.
Les réactifs antiglobuline doivent répondre à des exigences importantes de spécificité, de sensibilité et de contrôle de qualité afin de garantir la fiabilité des résultats du TDA.