La détection des réactions antigène-anticorps constitue un élément essentiel de l'interprétation des examens d'immuno-hématologie.
La présence d'un anticorps dans le plasma d'un patient ne signifie pas nécessairement qu'il sera détecté avec la même intensité par toutes les techniques. La sensibilité d'une réaction dépend notamment des caractéristiques de l'antigène et de l'anticorps, de la température, de la durée d'incubation, du milieu réactionnel, de la méthode utilisée et, dans certaines situations, du rapport entre la quantité d'antigène et la quantité d'anticorps.
Il est donc essentiel que les professionnels réalisant et interprétant les examens d'immuno-hématologie connaissent les caractéristiques et les limites des différentes méthodes utilisées.
Les principaux facteurs pouvant influencer la détection d'une réaction sont notamment :
- la température de réaction ;
- la durée et les conditions d'incubation ;
- le milieu réactionnel et les potentialisateurs ;
- la phase de détection utilisée ;
- le traitement enzymatique ou chimique des hématies ;
- la quantité relative d'antigène et d'anticorps ;
- la nature et la densité des antigènes ;
- les caractéristiques propres aux anticorps.
La température de réaction
La température constitue un facteur important de la réaction antigène-anticorps.
Les différents anticorps érythrocytaires ne présentent pas tous le même comportement en fonction de la température. Certains anticorps, notamment de nombreux anticorps de type IgM, présentent une meilleure réactivité à température ambiante ou à des températures plus basses. C'est notamment le cas de nombreux anticorps du système ABO et de certains anticorps dirigés contre des antigènes tels que P1, M, N ou Lewis.
À l'inverse, les allo-anticorps IgG cliniquement significatifs, notamment ceux dirigés contre des antigènes des systèmes Rh, Kell, Kidd ou Duffy, sont généralement recherchés dans des conditions permettant leur détection à 37 °C, notamment par des techniques faisant intervenir l'antiglobuline humaine.
Il est cependant incorrect d'attribuer cette différence uniquement à la nature chimique de l'antigène. La température optimale de réaction dépend principalement des caractéristiques de l'interaction entre l'antigène et l'anticorps ainsi que de la classe et des propriétés de l'anticorps.
Ainsi, une température de réaction inadaptée à l'anticorps recherché peut conduire à une diminution de la sensibilité de la technique.
La température doit donc toujours être celle prévue par la méthode utilisée et par la procédure validée du laboratoire.
La durée d'incubation
La durée d'incubation influence également la détection des anticorps.
L'incubation permet aux anticorps présents dans le plasma de rencontrer les antigènes correspondants présents à la surface des hématies et de s'y fixer.
Si la durée d'incubation est insuffisante, la quantité d'anticorps fixée peut être trop faible pour être détectée par la méthode utilisée. Une prolongation de l'incubation peut donc, dans certaines conditions, augmenter la sensibilité de la réaction.
La durée optimale dépend toutefois de la technique employée. Elle n'est pas nécessairement identique pour une technique en tube, une technique en microcolonne ou une autre méthode automatisée.
L'utilisation de milieux réactionnels particuliers peut également modifier la cinétique de fixation des anticorps. Le LISS (Low Ionic Strength Solution), par exemple, favorise l'adsorption des anticorps sur les hématies et permet généralement de réduire le temps d'incubation nécessaire tout en augmentant la sensibilité de la réaction.
La durée d'incubation ne doit donc pas être choisie arbitrairement : elle doit respecter les conditions définies et validées pour la méthode utilisée.
Le milieu réactionnel et les potentialisateurs
Le milieu dans lequel se déroule la réaction peut modifier considérablement la détection des anticorps.
Différents milieux ou potentialisateurs peuvent être utilisés afin d'améliorer la sensibilité des réactions antigène-anticorps. Parmi eux figurent notamment :
- les solutions de faible force ionique (LISS) ;
- l'albumine dans certaines techniques ;
- le polyéthylène glycol (PEG) ;
- certains autres milieux permettant de modifier les conditions physicochimiques de la réaction.
Ces substances peuvent notamment modifier les interactions entre les hématies et les anticorps ou favoriser la fixation des anticorps sur les antigènes.
La nature du milieu réactionnel doit donc être prise en compte lors de l'interprétation d'un résultat et lors de la comparaison avec des résultats obtenus par une autre méthode.
La phase de détection
La phase au cours de laquelle la réaction est recherchée constitue également un facteur déterminant.
En immuno-hématologie, un anticorps peut être détecté par différentes approches selon ses caractéristiques et la méthode utilisée.
La technique d'antiglobuline indirecte (TAI) permet notamment de mettre en évidence des anticorps, principalement des IgG, qui se sont fixés aux hématies au cours de l'incubation mais qui ne provoquent pas nécessairement une agglutination directe.
Le réactif d'antiglobuline humaine peut être :
- anti-IgG ;
- anti-complément, par exemple anti-C3d ;
- ou polyspecifique, contenant notamment une activité anti-IgG et anti-C3d.
Le choix du réactif et de la méthode influence donc le type de réaction détectée.
Il est ainsi possible qu'un même échantillon présente des résultats différents selon la méthode utilisée. Une réaction observée avec une technique particulière ne peut donc pas toujours être directement comparée à une réaction obtenue avec une autre technique sans tenir compte de leurs caractéristiques respectives.
Le traitement enzymatique des hématies
Certaines techniques d'immuno-hématologie utilisent des enzymes protéolytiques afin de modifier la membrane des globules rouges et d'améliorer l'étude de certains anticorps.
Les enzymes couramment utilisées comprennent notamment la papaïne, la broméline, la ficine et la trypsine.
Le traitement enzymatique ne renforce cependant pas toutes les réactions de manière identique.
Il peut :
- renforcer la réactivité de certains anticorps ;
- ne pas modifier significativement d'autres réactions ;
- détruire ou modifier certains antigènes et ainsi faire disparaître la réaction correspondante.
Les anticorps dirigés contre certains antigènes des systèmes Rh, Kidd et Lewis peuvent notamment présenter une réactivité accrue après traitement enzymatique, alors que certains antigènes, notamment ceux des systèmes MNS et Duffy, sont sensibles aux enzymes protéolytiques.
Le résultat obtenu avec des hématies traitées par enzyme doit donc être interprété en tenant compte des antigènes conservés ou détruits par le traitement.
Une technique enzymatique ne constitue donc pas une simple « technique plus sensible » que les autres : elle produit un profil de réactivité différent et constitue un outil complémentaire pour l'identification des anticorps.
La densité antigénique
La quantité d'antigène présente à la surface des hématies peut également influencer la force de la réaction.
Certains individus présentent une expression faible ou particulière d'un antigène. Un anticorps peut alors être moins facilement détecté avec des hématies faiblement exprimées pour l'antigène correspondant.
La densité antigénique peut également varier selon le génotype ou le phénotype de l'individu.
Lors de l'identification d'un anticorps, il est donc important de prendre en compte le profil antigénique des hématies utilisées dans le panel ainsi que l'intensité des réactions observées.
Le rapport entre antigènes et anticorps : prozone et postzone
La réaction d'agglutination dépend notamment du rapport entre la quantité d'anticorps et la quantité d'antigènes présents sur les hématies.
Dans certaines conditions, un excès important d'anticorps peut entraîner une diminution ou une absence apparente d'agglutination malgré la présence d'une réaction immunologique. Ce phénomène est appelé effet prozone.
Dans la prozone, les anticorps sont en quantité telle qu'ils peuvent saturer les sites antigéniques sans permettre la formation d'un réseau d'agglutination suffisamment important pour être observé.
Un résultat faussement négatif ou faiblement réactif peut ainsi être obtenu malgré la présence d'un anticorps.
Ce phénomène reste relativement inhabituel dans les examens courants mais doit être envisagé dans certaines situations, notamment lorsqu'un résultat paraît incohérent avec le contexte clinique ou avec d'autres résultats immuno-hématologiques. Des anticorps de titre très élevé peuvent notamment présenter un phénomène de prozone.
À l'inverse, un excès important d'antigènes par rapport aux anticorps peut également perturber la formation du réseau d'agglutination. Ce phénomène est appelé postzone.
Lorsque la présence d'une prozone ou d'une postzone est suspectée, une modification contrôlée du rapport antigène/anticorps, par exemple par dilution dans certaines méthodes, peut permettre de mettre en évidence une réaction qui était initialement faible ou absente. Cette investigation doit être réalisée conformément à une procédure validée.
Comparaison des résultats obtenus par différentes techniques
Les résultats obtenus en immuno-hématologie doivent toujours être interprétés en tenant compte de la technique utilisée.
Deux méthodes peuvent présenter des sensibilités différentes pour un même anticorps en raison de différences concernant :
- la température ;
- le temps d'incubation ;
- le milieu réactionnel ;
- le rapport plasma/hématies ;
- la phase de lecture ;
- le réactif d'antiglobuline ;
- la technologie utilisée ;
- le traitement éventuel des hématies ;
- les caractéristiques des hématies-tests ;
- les caractéristiques propres à l'anticorps.
Il est donc important de ne pas interpréter une différence d'intensité de réaction entre deux méthodes comme une variation nécessairement biologique du patient.
Une modification peut simplement refléter une différence de sensibilité ou de conditions expérimentales.
Importance de la connaissance des performances de la méthode
L'interprétation des résultats d'immuno-hématologie nécessite donc de connaître les caractéristiques de la méthode utilisée.
La sensibilité d'une technique ne peut pas être résumée à une seule valeur universelle. Elle dépend du type d'anticorps recherché, de son titre, de son affinité, de la densité de l'antigène, des conditions de réaction et de la technologie employée.
Les résultats doivent par conséquent être interprétés dans leur contexte et, lorsque cela est nécessaire, comparés aux résultats antérieurs en tenant compte des éventuelles différences de méthode.
La connaissance des performances et des limites des techniques constitue ainsi un élément essentiel de la qualité des analyses d'immuno-hématologie et de la sécurité transfusionnelle.