L'exploration immuno-hématologique d'une anémie hémolytique auto-immune (AHAI) repose principalement sur l'étude des globules rouges et du sérum du patient. Elle doit être interprétée en association avec les données cliniques et biologiques permettant de confirmer l'existence d'une hémolyse.
Le test direct à l'antiglobuline (TDA) constitue l'examen central du diagnostic immunologique. Il permet de rechercher la présence d'immunoglobulines et/ou de fractions du complément fixées sur les globules rouges du patient. Un TDA positif ne suffit toutefois pas, à lui seul, à établir le diagnostic d'AHAI : il doit être associé à des arguments biologiques d'hémolyse et au contexte clinique.
Les conditions préanalytiques sont particulièrement importantes lorsqu'une agglutinine froide est suspectée. Le prélèvement doit être acheminé rapidement au laboratoire et, selon les examens demandés, maintenu à une température permettant d'éviter la fixation ou la dissociation in vitro des anticorps froids. Pour les explorations nécessitant une conservation du sérum à chaud, notamment la recherche d'agglutinines froides, le sang peut être maintenu à 37-38 °C jusqu'à la séparation du sérum.
Caractéristique des auto-anticorps
Les AHAI peuvent être classées selon la température optimale d'activité et la classe d'immunoglobuline impliquée.
Auto-anticorps chauds
Les AHAI à auto-anticorps chauds représentent la forme la plus fréquente. Les auto-anticorps sont généralement de classe IgG et leur activité optimale se situe autour de 37 °C.
Ils se fixent aux globules rouges in vivo et sont généralement mis en évidence par un TDA positif avec l'antiglobuline anti-IgG, parfois associé à une fixation du complément (C3d).
Les spécificités des auto-anticorps chauds sont le plus souvent dirigées contre des antigènes érythrocytaires de grande fréquence, notamment du système Rh, mais peuvent concerner d'autres systèmes érythrocytaires.
Plus rarement, des AHAI à anticorps chauds peuvent être liées à des IgA ou des IgM. Ces formes peuvent nécessiter des examens immuno-hématologiques complémentaires, notamment l'utilisation d'antiglobulines monospecifiques anti-IgA et/ou anti-IgM dans des laboratoires spécialisés.
Auto-anticorps froids
Les AHAI à auto-anticorps froids sont principalement liées à des IgM capables d'activer la voie classique du complément.
La forme typique chez l'adulte est la maladie des agglutinines froides (MAF). Les auto-anticorps reconnaissent le plus souvent les antigènes du système I/i, en particulier l'antigène I chez l'adulte.
Le TDA est généralement positif avec l'anti-C3d et négatif ou faiblement positif avec l'anti-IgG.
La recherche d'une agglutinine froide repose notamment sur la détermination de son titre à 4 °C. Toutefois, le titre ne suffit pas à apprécier la signification clinique de l'anticorps : son amplitude thermique, c'est-à-dire la température maximale à laquelle l'anticorps reste capable de réagir avec les globules rouges, est également importante. Une réactivité à des températures supérieures à 30 °C est particulièrement susceptible d'être cliniquement significative.
Hémolysine biphasique de Donath-Landsteiner
L'hémolysine biphasique correspond à un auto-anticorps IgG, généralement dirigé contre l'antigène P. Elle est responsable de l'hémoglobinurie paroxystique à froid (HPF ou PCH).
Cet anticorps se fixe aux globules rouges à basse température et fixe le complément. Lorsque la température remonte vers 37 °C, l'activation du complément entraîne une hémolyse, généralement intravasculaire.
Cette propriété explique le caractère biphasique de la réaction : fixation à froid puis hémolyse lors du réchauffement.
Cette affection est particulièrement observée chez l'enfant, notamment après une infection, et peut provoquer une hémolyse aiguë parfois sévère. Le diagnostic repose sur le test de Donath-Landsteiner.
Etude globulaire
L'étude globulaire repose principalement sur la réalisation d'un test direct à l'antiglobuline (TDA).
Le TDA est réalisé avec des réactifs permettant de rechercher notamment :
- les IgG fixées sur les globules rouges ;
- la fraction du complément C3d.
L'association des résultats anti-IgG et anti-C3d contribue à orienter vers le type d'AHAI :
| Type d'AHAI | TDA habituel |
|---|---|
| AHAI à anticorps chauds | anti-IgG positif ± C3d |
| Maladie des agglutinines froides | C3d positif, anti-IgG généralement négatif |
| AHAI mixte | IgG positif + C3d positif |
| Hémoglobinurie paroxystique à froid | C3d positif ± IgG |
| AHAI à IgA/IgM | peut nécessiter un TDA élargi |
Ces profils ne sont toutefois pas absolument spécifiques et doivent être interprétés avec les autres résultats biologiques.
TDA négatif
Dans de rares situations, une AHAI authentique peut présenter un TDA négatif. Cela peut notamment s'expliquer par une faible quantité d'anticorps fixés sur les globules rouges, par la présence d'anticorps de faible affinité ou par un isotype d'immunoglobuline qui n'est pas détecté par les réactifs utilisés en routine.
Lorsque le contexte clinique et biologique reste fortement évocateur d'une AHAI, des investigations complémentaires peuvent être réalisées dans un laboratoire spécialisé :
- TDA avec des antiglobulines anti-IgA ;
- éventuellement anti-IgM ;
- méthodes plus sensibles de TDA ;
- élution des anticorps fixés sur les globules rouges.
Les AHAI à TDA négatif restent cependant des diagnostics d'exclusion : il est indispensable de rechercher les autres causes d'hémolyse.
Élution
L'élution consiste à détacher les anticorps fixés sur les globules rouges afin de les récupérer dans un éluat. Celui-ci peut ensuite être étudié par des techniques immuno-hématologiques afin de déterminer la présence et les caractéristiques des anticorps.
Elle peut notamment être utile dans certaines AHAI à anticorps chauds et dans les situations où la présence d'un anticorps fixé sur les globules rouges doit être caractérisée.
Etude sérique
L'étude sérique complète l'étude globulaire.
Une recherche d'anticorps irréguliers (RAI) doit être réalisée afin de rechercher des anticorps présents dans le plasma ou le sérum du patient.
En présence d'un auto-anticorps chaud, la RAI peut révéler une réaction avec plusieurs ou toutes les cellules-tests. Il est alors important de rechercher la présence éventuelle d'un allo-anticorps associé, notamment chez les patients ayant été transfusés antérieurement.
L'exploration doit donc permettre de distinguer les auto-anticorps des éventuels allo-anticorps afin de sécuriser la prise en charge transfusionnelle.
Exploration d'une AHAI à anticorps chauds
En présence d'une AHAI à anticorps chauds, le TDA est généralement positif avec l'anti-IgG, avec ou sans C3d.
La RAI est généralement positive et peut montrer une réactivité large correspondant à un auto-anticorps chaud. Lorsque cette réactivité masque la présence éventuelle d'un allo-anticorps, des techniques spécialisées d'adsorption peuvent être utilisées afin d'éliminer l'auto-anticorps et de rechercher un éventuel allo-anticorps sous-jacent.
Une élution peut également être réalisée sur les globules rouges du patient afin de caractériser les anticorps qui y sont fixés.
Ces investigations sont particulièrement importantes chez les patients ayant des antécédents transfusionnels, car un allo-anticorps peut être masqué par un auto-anticorps.
Exploration d'une AHAI à anticorps froids
Lorsqu'une AHAI à anticorps froid est suspectée, la recherche d'une agglutinine froide est réalisée sur le sérum.
Le premier examen consiste généralement à rechercher une agglutination des hématies-tests à basse température, puis à déterminer le titre de l'anticorps à 4 °C lorsque cela est nécessaire.
Un titre ≥ 64 est classiquement considéré comme significatif dans le contexte approprié. Cependant, le titre doit être interprété avec la clinique et le TDA, car des agglutinines froides de faible titre peuvent être présentes chez des sujets sains.
L'amplitude thermique peut également être déterminée. Elle correspond à la température maximale à laquelle l'anticorps conserve une activité. Elle est particulièrement importante pour évaluer le caractère potentiellement pathogène de l'anticorps.
Les auto-anticorps froids peuvent notamment présenter des spécificités anti-I ou anti-i.
Recherche d'une hémolysine biphasique : test de Donath-Landsteiner
Lorsque le contexte clinique et biologique évoque une hémoglobinurie paroxystique à froid, notamment chez un enfant présentant une hémolyse aiguë associée à une hémoglobinurie, le test de Donath-Landsteiner peut être réalisé.
Ce test met en évidence le caractère biphasique de l'auto-anticorps.
Le principe consiste à mettre en présence le sérum du patient et des globules rouges en présence de complément, puis à comparer des conditions d'incubation à basse température et à 37 °C.
Dans le test positif :
- l'anticorps se fixe sur les globules rouges à basse température ;
- le complément est fixé ;
- lors du réchauffement à 37 °C, l'activation du complément entraîne une hémolyse.
La présence d'une hémolyse dans ces conditions, avec absence d'hémolyse dans les témoins appropriés, permet de mettre en évidence une hémolysine biphasique de Donath-Landsteiner.
L'anticorps est généralement une IgG anti-P.