Pour réaliser le groupage ou le phénotypage érythrocytaire, les laboratoires disposent de différentes techniques permettant de mettre en évidence les antigènes présents à la surface des globules rouges ou les anticorps présents dans le plasma ou le sérum.
Ces techniques reposent principalement sur l'hémagglutination. Celle-ci peut être directement visible lorsque les anticorps, notamment certaines IgM, sont capables de rapprocher suffisamment les hématies pour former des amas. Les anticorps IgG, en raison de leur petite taille et de leur caractère monomérique, ne provoquent généralement pas d'agglutination directe. Leur fixation peut cependant être révélée par différentes techniques, notamment le test à l'antiglobuline humaine, l'utilisation de milieux favorisant la réaction ou le traitement enzymatique des hématies.
Agglutination directe
L'agglutination directe survient lorsqu'un anticorps rencontre l'antigène correspondant à la surface des globules rouges et permet de former un réseau d'hématies agglutinées. Les IgM sont particulièrement efficaces dans ce phénomène en raison de leur structure pentamérique.
Les IgG sont généralement trop petites pour provoquer seules une agglutination visible. Leur fixation sur les hématies peut toutefois être mise en évidence à l'aide de techniques complémentaires.
Technique saline en tube
La technique en tube consiste à mettre en contact les globules rouges du patient avec le réactif contenant l'anticorps recherché. Après incubation, lorsque celle-ci est nécessaire, le tube est centrifugé puis les hématies sont remises délicatement en suspension.
Une réaction positive se traduit par la présence d'amas d'hématies, tandis qu'une réaction négative correspond à une suspension homogène de globules rouges.
La technique en tube reste une méthode de référence et peut être particulièrement utile pour l'étude de résultats complexes ou discordants.
Microplaque :
La microplaque permet de réaliser les réactions dans de petits puits et facilite leur automatisation. Les réactifs et les hématies sont mis en contact dans les puits, puis la réaction est analysée après centrifugation et remise en suspension selon le système utilisé.
Certains systèmes peuvent utiliser des milieux ou des traitements enzymatiques permettant d'augmenter la réactivité de certains anticorps. Les enzymes protéolytiques, telles que la broméline, la papaïne ou la ficine, peuvent notamment modifier certains antigènes membranaires et réduire les charges négatives portées par les hématies, ce qui favorise leur rapprochement.
Agglutination en colonne :
La technique d'agglutination en colonne, notamment sous forme de gel ou de microbilles, est largement utilisée en immuno-hématologie. Les hématies et les réactifs sont déposés dans une microcolonne contenant un gel ou des particules.
Après incubation et centrifugation, les hématies non agglutinées traversent la colonne et forment un culot au fond. Les hématies agglutinées sont retenues à différents niveaux de la colonne en fonction de la taille des agrégats.
Cette technique est particulièrement adaptée à l'automatisation et permet une lecture standardisée des réactions.
Test indirect à l'antiglobuline (TIA)
Le test indirect à l'antiglobuline, ou test de Coombs indirect, permet de mettre en évidence des anticorps présents dans le plasma et capables de se fixer sur des antigènes érythrocytaires.
La technique comporte généralement deux étapes :
- Sensibilisation des hématies : le plasma ou le sérum à étudier est incubé avec des hématies possédant les antigènes recherchés.
- Révélation : après incubation, les hématies sont mises en présence d'une antiglobuline humaine, généralement anti-IgG. Celle-ci se fixe sur les immunoglobulines déjà présentes à la surface des hématies et peut provoquer leur agglutination.
En technique en tube, les hématies doivent être soigneusement lavées avant l'ajout de l'antiglobuline afin d'éliminer les immunoglobulines libres qui pourraient neutraliser le réactif antiglobuline.
Le TIA est notamment utilisé pour la recherche et l'identification des anticorps irréguliers, certains phénotypages et les épreuves de compatibilité transfusionnelle.
Technique en tube :
Après incubation du plasma avec les hématies, celles-ci sont lavées plusieurs fois avec une solution saline afin d'éliminer les anticorps libres. L'antiglobuline humaine est ensuite ajoutée.
Après centrifugation, une agglutination indique que des immunoglobulines, principalement des IgG, étaient fixées aux hématies.
Technique en colonne :
Dans les systèmes en gel ou en microcolonne, le lavage manuel des hématies n'est généralement pas nécessaire. Les hématies sensibilisées sont introduites dans une colonne contenant le milieu de séparation et, selon le système, l'antiglobuline.
Après centrifugation, les hématies non agglutinées migrent jusqu'au fond de la colonne tandis que les hématies agglutinées sont retenues dans le gel ou à différents niveaux de celui-ci.
Immuno-adhérence
L'immuno-adhérence est une technique permettant de révéler indirectement la fixation d'anticorps sur des hématies. Elle repose sur l'utilisation d'hématies révélatrices portant des récepteurs capables d'interagir avec les complexes immunologiques formés.
Cette méthode a été utilisée dans certaines techniques de groupage ou de recherche d'anticorps, mais elle est aujourd'hui beaucoup moins utilisée en pratique courante que les techniques en tube, en microplaque, en gel ou en colonne.
Autres techniques
D'autres méthodes peuvent également être utilisées dans certaines situations particulières, notamment :
- la cytométrie en flux, permettant notamment de détecter et de quantifier la fixation d'anticorps sur les hématies ;
- les techniques ELISA, utilisées dans certaines applications spécialisées ;
- l'immunofluorescence, principalement dans des applications de recherche ou spécialisées.
En pratique courante d'immuno-hématologie transfusionnelle, les techniques en tube, les systèmes automatisés et les techniques d'agglutination en colonne constituent les principales méthodes utilisées.