Immuno-Hématologie Erythrocytaire

Test Direct à l'Antiglobuline

Le Test Direct à l'Antiglobuline (TDA), anciennement Test de Coombs Direct (TCD), permet, grâce à un sérum d'antiglobuline humaine, de révéler la présence d'anticorps fixés sur l'antigène correspondant, à la surface de l'hématie in vivo et susceptible d'entraîner leur destruction (hémolyse).

L'antiglobuline utilisée est essentiellement de deux classes : un anti-IgG ou un anti-Complément. L'antiglobuline Anti-IgG est composée d'immunoglobulines dirigées contre le fragment Fc de l'IgG. Celle-ci peut donc mettre en évidence des anticorps de type IgG fixés sur les globules rouges testés. L'antiglobuline de type anti-complément est essentiellement composée d'anti-C3d. Le C3d est présent en grande quantité et de façon relativement stable à la surface des globules rouges sensibilisés in vivo à la suite de l'activation du complément par certains complexes immuns anticorps-antigène.

Le Test Direct à l'Antiglobuline (TDA) est essentiellement utilisé lors de la recherche de Maladies Hémolytiques du Nouveau-Né (MHNN), d'une réaction transfusionnelle, d'Anémie Hémolytique Auto-Immune (AHAI) et d'anémie hémolytique d'origine médicamenteuse afin de révéler un conflit immunologique.

La positivité d'un TDA est le témoin de la sensibilisation des hématies in vivo. Pour que la réaction puisse être positive, il faut au minimum 200 molécules d'Ig ou de C3d sur le globule rouge. Mais cela ne correspond pas forcément à une hémolyse ou une anémie chez le patient. Inversement, un TDA négatif ne signifie pas l'absence d'hémolyse à la suite d'un conflit immunologique.

Schéma de l'action des antiglobules sur les hématies sensibilisées

 

Différentes techniques


Les laboratoires d'immuno-hématologie possèdent principalement deux techniques (en technique saline et par filtration) afin de mettre en évidence la sensibilisation des globules rouges par les anticorps. Ces deux techniques ont des limites de détection différentes.

 

Technique saline :

Cette technique n'est pas utilisée en technique de routine. Elle consiste à diluer les globules rouges du patient avec de l'eau physiologique après avoir réalisé un lavage des hématies, puis de mettre en contact les hématies diluées avec l'antiglobuline IgG ou l'antiglobuline C3d. Le lavage des hématies est une étape importante car il permet d'éliminer le plasma contenant les immunoglobulines non fixées, évitant la neutralisation de l'antiglobuline réactionnelle par les anticorps du plasma. Afin de garantir les résultats des analyses, il est indispensable de réaliser un témoin réactif. Ce témoin réactif est composé des mêmes constituants que les autres réactifs (anti-IgG et anti-C3d) sans les anticorps spécifiques. Toute positivité de ce témoin ne permet pas la validation des analyses.

Voici l'image que peuvent donner les résultats en tubes :

photo des réactions d'un test de coombs direct en tube

 

Technique par filtration :

Cette technique est à l'heure actuelle la plus répandue, autant en technique manuelle, que par les appareils automatisés. Cette technique nécessite l'utilisation d'une cassette constituée d'une micro-cupule surmontant une colonne de filtration. Cette colonne de filtration contient des micro-billes ou du gel et de l'antiglobuline (soit IgG, soit C3d).

Après avoir mis les globules rouges du patient dans la cupule, la cassette est centrifugée. Lors de cette centrifugation, les globules rouges sont dirigés au fond de la colonne de filtration. Pendant cette phase de migration, l'antiglobuline va se fixer sur les hématies sensibilisées. Les hématies ayant fixé l'antiglobuline seront bloquées par les billes ou le gel. Elles ne vont donc pas atteindre le fond de la colonne. Ces cassettes possèdent également un témoin réactif (contrôle) qui doit être négatif pour pouvoir interpréter les résultats.

Voici l'image que peuvent donner les résultats en filtration :

Photo d'une cassette de Coombs direct avec des résultats

 

  • Autres techniques :

Il est également possible de réaliser un TDA en microplaque, soit par immuno-adhérence, soit par magnétisation des hématies.

 

TDA avec de l'anti-IgG


Le Test Direct à l'Antiglobuline (TDA) avec de l'anti-IgG permet de mettre en évidence une sensibilisation (complexe immun anticorps-antigène) des globules rouges par un anticorps de classe IgG. La mise en évidence de ce complexe immun est très importante lors de la recherche d'une maladie hémolytique du Nouveau-né (MHNN) suite à une incompatibilité foeto-maternelle (IFM), et lors d'un problème suite à une transfusion sanguine de globules rouges.

Les anticorps IgG ont une importance particulière dans ces deux conflits immunologiques, car leurs conséquences peuvent être graves. Dans les MHNN, le nouveau-né, en absence d'intervention rapide, peut selon l'anticorps, avoir des conséquences neurologiques graves. En transfusion, la mise en évidence d'anticorps fixés sur les globules rouges permet de confirmer un conflit immunologique.

Dans tous les cas où une sensibilisation avec un anticorps IgG est mise en évidence dans un contexte de conflit immunologique, il faudra déterminer l'anticorps responsable de la sensibilisation des hématies. Pour cela, une élution est réalisée. Celle-ci permet de décrocher les anticorps fixés sur les globules rouges. Puis, une identification des anticorps élués sera réalisée.

 

TDA avec de l'anti-C3d


Le Test Direct à l'Antiglobuline (TDA) avec de l'anti-C3d (anti-complément) permet de mettre en évidence une sensibilisation (complexe immun anticorps-antigène) des globules rouges par un anticorps de classe IgM ou IgG ayant activé le complément.

Les anticorps de type IgM ne présentent pas de danger en transfusion sanguine et ne passent pas la barrière du placenta lors des grossesses. Ils présentent donc très peu d'intérêt en transfusion. Son intérêt principal est de confirmer la présence d'un auto-anticorps dans le sérum du patient lorsque celui-ci a été identifié lors de la recherche d'agglutinines irrégulières et lors de maladie hémolytique auto-immune.

 

TDA dit «mixte»


Un Test Direct à l'Antiglobuline (TDA) est dit "mixte" lorsqu'il y a une réaction positive des réactifs anti-IgG et anti-C3d avec les globules rouges du patient. Cette double réactivité met en évidence la présence sur les antigènes des hématies (sensibilisation) d'anticorps de type IgG. Ces IgG ont la capacité d'activer le complément ce qui induit une réaction positive avec l'anti-complément. L'anticorps le plus fréquent qui donne ce type de résultat est l'anti-JK1.

Les anticorps IgG ont une importance particulière dans les conflits immunologiques car leurs conséquences peuvent être graves. Les maladies hémolytiques du nouveau-né (MHNN) sont dues à ce type d'anticorps. En transfusion, la mise en évidence d'anticorps fixés sur les globules rouges permet de confirmer un conflit immunologique.

Dans tous les cas où une sensibilisation à un anticorps IgG est mise en évidence, il faudra déterminer l'anticorps responsable de cette immunisation.

 

Fabrication des antiglobulines humaines (AGH)


L'antiglobuline humaine est obtenue par l'injection à des lapins de fractions de plasma humain. Cette injection provoque une réaction immunitaire du lapin et ainsi la production d'anticorps anti-anticorps humains, appelé antiglobulines humaines. Ces anticorps sont de différents types selon l'injection réalisée sur le lapin : anti-IgG, anti-C3d, anti-C3b, anti-C4b, anti-C4d ou anti-IgA.

L'immunisation des lapins permet d'obtenir des réactifs polyclonaux. La souris est également utilisée pour la fabrication des antiglobulines humaines. Dans ce cas, l'immunisation des souris permet d'obtenir des antiglobulines monoclonales.