Immuno-Hématologie Erythrocytaire

Techniques

Les laboratoires d'immuno-hématologie possèdent plusieurs techniques pour rechercher des anticorps irréguliers (RAI), développées ces dernières années et apportant chacune leur intérêt et leurs limites de détection.

 

1. Technique en tubes :

Cette technique n'est pas utilisée en technique de routine. Elle est utilisée pour mettre en évidence des anticorps ayant une température optimum de 4°C et agglutinant de façon spontanée. On met donc en contact le sérum ou le plasma avec le panel d'hématies O dans des tubes de verre à la température de 4°C. Les tubes sont ensuite centrifugés, puis remis en suspension par agitation douce afin de voir les agglutinations éventuelles. Cette technique ne met en évidence que les anticorps de type IgM.

 

2. Technique en plaque :

La réalisation des dépistages des recherches d'anticorps irréguliers (RAI) se fait sur des micro-plaques comme pour la détermination des antigènes de groupe sanguin. Le sérum ou le plasma du patient est mis en contact avec les hématies du panel de dépistage dans des microcupules. Les hématies du panel de dépistage utilisé sont magnétisées selon la méthode breuvetée de Diagast. Après incubation à 37°C, un champ magnétique est appliqué sur la cupule afin que les hématies magnétisées migrent au fond de la cupule à travers un gel. Ces cupules contiennent sur leur paroi des antiglobulines fixant les anticorps IgG éventuellement fixés sur les globules rouges lors de l'incubation. Ces hématies sensibilisées ne migreront pas au fond de la cupule, mais resteront sur les bords. Cette technique ne reconnait que les anticorps de type IgG.

 

3. Immuno-adhérence en microplaque :

La recherche des anticorps irréguliers s'effectue sur les microplaques en U dans lesquelles les hématies tests sont fixées. Le sérum ou plasma du patient est ensuite incubé dans cette plaque à 37°C. Les cupules sont ensuite lavées. Seuls les anticorps fixés sur les hématies tests restent dans les cupules. Afin de révéler la présence de ces anticorps, on y ajoute une antiglobuline de type IgG fixée sur des hématies révélatrices. Après centrifugation, une réaction positive est observée lorsque les hématies révélatrices restent sur les parois des cupules. Une réaction négative est déterminée lorsque tous les globules rouges se retrouvent au fond de la cupule.

 

4. Technique par filtration :

Cette technique est à l'heure actuelle la plus utilisée, autant en technique manuelle, que par les automates. Cette technique necessite l'utilisation d'une cassette constituée d'une micro-cupule surmontant une colonne de filtration. Cette colonne de filtration contient des micro-billes ou du gel et l'antiglobuline lorsqu'on souhaite réaliser le test à l'antiglobuline.

Après avoir mis le sérum ou le plasma du patient dans la cupule en contact des hématies du panel de dépistage ou d'identification, la cassette est incubée à 37°C, puis centrifugée. Lors de cette centrifugation, les globules rouges sont dirigés au fond de la colonne de filtration. Pendant cette phase de migration, les hématies possédant un complexe immun antigène-anticorps vont être bloquées par les billes. Ils ne vont donc pas atteindre le fond de la colonne.

Les colonnes de filtration peuvent contenir une antiglobuline Poly (anti-IgG et anti-complément) ou une antiglobuline anti-IgG. Les anticorps recherchés ne sont pas les mêmes selon l'antiglobuline utilisée.

 

5. Traitement des hématies par les enzymes protéolytiques :

Les enzymes protéolytiques, d'origine animale ou végétale (trypsine, papaïne, bromeline, ficine, pronase ...), libèrent des fragments polypeptidiques qui appartiennent aux glycoprotéines. Les hématies ainsi traitées sont alors agglutinables par les anticorps IgG normalement non agglutinants; par exemple, l'IgG anti-D agglutine les hématies traitées par les enzymes; cette propriété n'est pas liée au démasquage de nouveaux déterminants antigéniques.

Le mécanisme en général invoqué pour expliquer l'action des enzymes est celui de la diminution du potentiel zeta du système, du fait que les fragments polypeptidiques libérés contiennent des molécules d'acide sialique, responsables en grande parie de la charge électrique de la membrane.

 

6. test de coombs indirect :

Ce test permet, grâce à un sérum antiglobuline humaine, de révéler la présence d'anticorps spécifiques (donc immunoglobuline) fixé sur l'antigène correspondant à la surface de l'hématie, dans le cas où cette fixation ne s'est pas traduite par l'agglutination directe des hématies.

Schma de l'agglutination grace  l'antiglobuline humaine

 

Le test de coombs indirect est utile dans la détermination de certains phénotypes érythrocytaires ou bien dans la recherche des agglutinines présentes dans le sérum en plaque, en filtration ou en tubes et dans l'épreuve de compatibilité. La réaction comporte les deux temps suivants :

  1. fixation de l'anticorps sur les hématies par l'incubation de la suspension globulaire avec le sérum étudié
  2. après éventuellement, un lavage des hématies en milieu salin (destiné à éliminer toute trace d'immunoglobulines sériques qui inhiberaient l'antiglobuline), mise en présence du sérum antiglobuline qui provoque l'agglutination en cas de réaction positive.

Les principaux anticorps présents dans une antiglobuline polyvalente doivent avoir une spécificité anti-IgG et anticomplément.