Immuno-Hématologie Erythrocytaire

Techniques

Pour réaliser le groupage ou le phénotypage d'un individu, les laboratoires spécialisés possèdent plusieurs techniques qui ont été développées avec les progrès techniques scientifiques. Ces techniques consistent à mettre en évidence la réaction antigène-anticorps (agglutination) afin de déterminer la présence de l'antigène à la surface des globules rouges. Cette hémagglutination peut-être soit spontanée, c'est à dire visible à l'oeil nu, soit révélée par un test à l'antiglobuline.

 

1. Agglutination spontanée :

Cette agglutination est provoquée lorsqu'un anticorps de type IgM essentiellement rencontre l'antigène correspondant. Il se forme alors un complexe immun qui est visible à l'oeil. Cela se caractérise par un amas de globules rouges avec un éclaircissement de la solution réactionnelle. La visibilité de cette agglutination est due à la capacité de ces anticorps a créer un réseau avec les hématies.

Schma de l'agglutination

Les IgG par leur caractère monomère n'ont pas le pouvoir d'agglutination direct sauf pour l'IgG3 qui a une fraction Fc plus longue. Cette fraction lui permet de créer un réseau par adhérence des fractions Fc entre elles.

Pour mettre en évidence les hémagglutinations spontanées et ainsi déterminer le groupe ou le phénotype d'un patient, il existe plusieurs techniques.

 

a. technique saline (tube) :

Cette technique consiste à mettre en contact l'anti-sérum avec les globules rouges dilués du patient dans un tube à essai. Ce tube est ensuite centrifugé de façon modérée afin de mettre les hématies au fond du tube. Par une agitation douce, les globules rouges libres se diluent dans le tube; alors que s'il y a eu réaction d'agglutination, un amas reste au fond du tube. Cette méthode est très utilisée lors de difficultés de groupage sanguin car elle permet une meilleure visibilité réactionnelle entre l'anticorps et l'antigène.

b. microplaque :

Cette technique est identique à celle en tube. Elle a été mise en place afin de permettre l'automatisation de la méthode en tube. La réaction se fait donc dans des micro-cupules positionnées sur une plaque. La lecture de la réaction est réalisée par le lecteur de l'automate. Cette technique nécessite l'utilisation d'une enzyme protéolytique, la bromeline, qui permet de diminuer le potentiel zêta des globules rouges afin de faciliter le contact des anticorps avec les antigènes et ainsi accélérer la réaction d'hémaglutination.

La société Diagast a innové cette technique avec la magnétisation des hématies. Cette magnétisation a permis de supprimer la centrifugeuse sur l'automate et ainsi gagner de la place. Les hématies magnétisées sont mises au fond de la cupule par l'action d'un champ magnétique.

c. filtration :

Cette technique nécessite l'utilisation d'une cassette. Cette cassette est constituée d'une micro-cupule pour mettre les globules du patient, surmontant une colonne de filtration. Cette colonne de filtration contient des micro-billes ou du gel et l'anti-sérum de l'antigène à rechercher. Après avoir mis les globules rouges dilués du patient dans la cupule, la cassette est centrifugée. Lors de cette centrifugation, les globules rouges sont dirigés au fond de la colonne de filtration. Pendant cette phase de migration, les hématies possédant l'antigène recherché vont se sensibiliser (fixation de l'anticorps). Ce complexe immun va donc avoir une taille plus importante qu'initialement et va être bloqué par les billes ou le gel. Il ne va donc pas atteindre le fond de la colonne. Cette technique peut-être automatisée.

 

2. Test à l'antiglobuline (coombs) :

Ce test permet, grâce à un sérum antiglobuline humaine, de révéler la présence d'anticorps spécifique fixé sur l'antigène correspondant à la surface de l'hématie.

Schma de l'agglutination grace  l'antiglobuline humaine

Le test de coombs indirect est utile dans la détermination de certains phénotypes érythrocytaires ou bien dans la recherche des agglutinines présentes dans le sérum. La réaction comporte deux temps :

  1. fixation de l'anticorps sur les hématies par l'incubation de la suspension globulaire avec le sérum étudié, pendant plusieurs minutes
  2. après, éventuellement, un lavage des hématies en milieu salin (destiné à éliminer toute trace d'immunoglobulines sériques libres qui risqueraient d'inhiber l'antiglobuline), les hématies sont mises en présence du sérum antiglobuline qui permet la mise en évidence de l'éventuelle réaction positive, par la création d'un réseau.

Ce test à l'antiglobuline est utilisé pour des techiques en tube et en filtration.

a. tubes :

La technique de départ est la même que lors d'une agglutination spontanée. Mais, après la centrifugation, les globules rouges sont lavés à l'eau physiologique (eau contenant du NaCl). Ces étapes de lavage permettent d'éliminer les anticorps libres de l'antisérum et ainsi éviter qu'ils ne saturent les Fab de l'antiglobuline. L'antiglobuline est ensuite ajoutée puis le tube est de nouveau centrifugé. L'antiglobuline va donc créer un réseau entre les complexes immuns, révelant ainsi l'agglutination.

b. filtrations :

Cette méthode utilise des cassettes contenant une micro-cupule surmontant une colonne de filtration d'antiglobuline. L'antisérum est ajouté aux globules rouges du patient dans la micro-cupule. La cassette est ensuite incubée 15 à 20 minutes à 37°C avant d'être centrifugée. Lors de cette centrifugation, les globules rouges vont migrer au fond du tube. L'antiglobuline contenue dans la colonne de filtration, va se fixer sur les hématies sensibilisées lors de l'incubation dans la micro-cupule. Ce nouveau complexe va donc avoir une taille qui va l'empêcher de migrer dans la colonne de billes. Dans cette technique, le lavage des hématies n'est pas nécessaire, car la concentration en antiglobuline est importante dans la cassette, limitant le risque de saturation des Fab de l'anglobuline.

 

3. Immuno-adhérence :

Le méthode consiste à fixer préalablement les hématies du patient sur les parois des cupules de la microplaque. L'antisérum du phénotype à déterminer est ensuite ajouté à la cupule afin de permettre la rencontre entre les hématies et l'antisérum. Après incubation, la cupule est lavée avec une solution saline 0,15 M pour éliminer les protéines non spécifiquement fixées. Les anticorps ayant été fixés sur les antigènes sont mis en évidence par immunoadhérence à l'aide d'hématies révélatrices sur lesquelles est fixée de l'antiglobuline humaine. Les plaques sont ensuite centrifugées. Une réaction négative est caractérisée par un bouton cellulaire au centre de la cupule.

 

4. Autres techniques :

Il existe d'autres techniques mais moins utilisées à l'heure actuelle :

  • Cytométrie de flux
  • ELISA
  • Immunofluorescence